客戶只需提供樣品和待檢測基因名稱即可。由我們提取RNA，設(shè)計(jì)并合成引物，完成熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告給您。

熒光定量PCR試劑盒技術(shù)：
產(chǎn)品僅用于科研本實(shí)用新型技術(shù)公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括盒體，盒體由上盒體和下盒體組成，上盒體的底面上設(shè)有限位凸起，下盒體的頂面上設(shè)有與限位凸起匹配的凹槽，且在下盒體左右側(cè)壁的下端均軟連接有側(cè)蓋，側(cè)蓋遠(yuǎn)離下盒體的一端連接有卡勾，下盒體的上端邊緣處設(shè)有環(huán)形凸起，兩個(gè)卡勾分別勾住環(huán)形凸起的左右兩端將上盒體固定在下盒體上；凹槽的內(nèi)部設(shè)有固定桿，固定桿上通過轉(zhuǎn)動(dòng)件轉(zhuǎn)動(dòng)連接有用于放置試管的試管架；下盒體的左右兩側(cè)均設(shè)置有收納槽。本實(shí)用新型技術(shù)通過將盒體分為上下組合的兩個(gè)部分，并將兩個(gè)部分通過側(cè)蓋連接，即可保證試劑盒的便攜性，同時(shí)使用試劑盒自帶的試管可提高檢測的效率。
樣品RNA的抽提：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。
鹽酸甲氧那明Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) Blocking Peptide2-氯噻吩-5-磺酰

(S)-1-基-1,2,3,四氫異喹啉 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb (Biotinylad)甲基磺酰芐溴

鹽酸羅沙替丁醋酸酯Synapsin-1 (D12G5) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)alpha-溴代-氯乙酮

培美曲塞酸Phospho-Akt (Ser473) Blocking Peptide2-溴-甲酸

培美曲塞酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Blocking Peptide溴-氯甲

尼泊金甲酯；對(duì)羥基甲酸甲酯S6 Ribosomal Proin Blocking Peptide2-甲基巰基-5-溴嘧啶-羧酸

尼泊金酯；對(duì)羥基甲酸酯 Zap-70 Blocking Peptide5-氨基-1-甲基-1H-吲唑

周效磺(磺多辛)Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Blocking Peptide氮雜環(huán)庚烷-酮鹽酸鹽

周效磺(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-EGF Receptor (Tyr1173) Blocking Peptide2-溴-5-(三氟甲基)吡啶

乙偶姻Phospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) Blocking Peptide2-溴-氟-6-硝

青霉素G鈉鹽ATF-4 (D4B8) Rabbit mAb2,6-二氟肼鹽酸鹽

青霉素G鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)DEPTOR/DEPDC6 (D9F5) Rabbit mAb3,5-二三氟肼鹽酸鹽

米格列奈鈣Phospho-GRB10 (Ser476) (D4E6) Rabbit mAbN-(2,二氯芐基)

米格列奈鈣(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) (D7D11) Rabbit mAb氟乙

基硫氧嘧啶 /6-正基-2-硫代尿嘧啶Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) (D7D11) Rabbit mAb異基

氟米龍醋酸酯TCF12/HEB (D2C10) Rabbit mAb叔丁基

十溴二FKBP4 Antibody2-噻吩磺酰

氨基雜環(huán)鹽酸鹽Arrestin 1/S-Arrestin Antibody(溴甲酰)酸
巴貝斯屬蟲通用探針法熒光PCR檢測試劑盒FAM172A蛋白(FAM172A)ELISA試劑盒CRF/CRH  促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子抗體20 ul

E選擇素(E-Selectin/CD62E)ELISA試劑盒CRF/CRH  促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子抗體100 ul

E鈣粘著蛋白/上皮性鈣黏附蛋白(E-Cad)ELISA試劑盒CRHR1/CRFR1  促腎上腺皮質(zhì)釋放激素受體1抗體20 ul

E3泛素蛋白連接酶TRIM68(TRIM68)ELISA試劑盒CRHR2/CRFR2  促腎上腺皮質(zhì)釋放激素受體2抗體100 ul

D-酸脫氫酶(D-LDH)ELISA試劑盒CSIG  細(xì)胞衰老抑制基因抗體300 ul

D-酸ELISA試劑盒Cripto-1(NT)  畸胎瘤衍化生長因子抗體(N端)100 ul

D-甘油3-酸ELISA試劑盒Cripto-1  畸胎瘤衍化生長因子抗體(C端)25 ul

D二聚體(D2D)ELISA試劑盒CSMD1  CSMD1抗體250 ul

DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)ELISA試劑盒CRTAM  CRTAM抗體100 ul
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
    10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μ
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
      加ddH2O至               50 μl
   視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．產(chǎn)品僅用于科研所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。