熒光定量PCR常見問題及解答
一、無 Ct 值（信號）出現(xiàn)：
1.反應循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號；
2.檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用 72℃延伸時采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結束或延伸結束采集信號；
3.引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；
4.探針設計不佳：設計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；
5.模板量少：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的zui高濃度做起；
6.模板降解：避免樣品制備中雜質的引入以及模板反復凍融的情況發(fā)生。
二、如何確認模板中是否含有 PCR 反應阻害物質：
有時RNA或cDNA模板中存在對反轉錄和熒光PCR 反應的阻害物質。為了確認這樣的阻害物質的有無，我們可以使用高濃度的模板按 3－4 個梯度稀釋，并使用其進行熒光定量 PCR 反應。如果無阻害物質存在，得到的 Ct 值就會依模板濃度的變化而變化；而如果模板中有阻害物質的存在，實驗過程中我們就會發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應性能下降的現(xiàn)象。
三、Ct值出現(xiàn)過晚：
1.反應條件不佳：未*反應條件，可重新設計引物或探針，適當降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；
2.PCR各種反應成分的降解或加樣量不夠；
3.擴增產(chǎn)物片段過長：一般采用 100－200bp 的擴增長度。
四、標準曲線的線性關系不佳：
1.加樣存在誤差，標準品稀釋不呈梯度；
2.標準品降解：標準品盡量避免反復凍融；
3.引物或探針不佳：重新設計；
4.模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
五、陰性對照液出現(xiàn)明顯的擴增：
1.熒光 PCR mix 或水被污染；
2.引物二聚體的出現(xiàn)：在 35 循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合溶解曲線進行分析；
3.反應過程中探針降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。
六、溶解曲線不止一個主峰：
1.引物設計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)；
2.引物濃度不佳：適當調整引物濃度；
3.退火溫度低：提高退火溫度；
4.鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度；
5.模板中有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組 DNA 的污染，或通過引物設計避免非特異擴增。
七、如何避免熒光定量PCR中基因組DNA擴增：
1.引物設計時避免基因組DNA擴增；
2.在RNA提取過程中使用DNaseⅠ處理去除RNA中混有的基因組DNA。
熒光定量PCR常見問題及解答
八、擴增效率低：
1.反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解；
2.反應條件不佳：適當降低退火溫度或改為三步擴增法；
3.反應體系中有抑制物：一般為模板中引入，應先把模板適當稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
九、重復性不好：
1.加樣不準確；
2.儀器在樣品上溫度條件有差異，溫度均一性不好；
3.模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數(shù)。
十、擴增曲線不正常，剛進入指數(shù)期就很快進入平臺期并向右下彎曲：
1.基線等設置不當：按儀器說明書重新操作；
2.模板量過多：當擴增曲線在10個循環(huán)內起峰時，應將模板稀釋100－1000倍后使用。
十一、各孔間的熒光信號如何進行校正：
由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正，以消除這些因素對定量結果的影響。這種校正可以通過在反應體系中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強度與反應體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異。
十二、熒光定量PCRCT值一般在多少后認為模板沒擴增：
當進入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時，Real Time RT-PCR檢測無效，基因沒有表達；當進入對數(shù)的循環(huán)數(shù)在 32-35 個循環(huán)時，需要有至少 3 個重復才能判斷是否能檢測到基因的表達。
