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| Western Blot基本原理 |
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| 點擊次數(shù)：2527 更新時間：2011-05-20 |
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一個基因表達*結(jié)果是產(chǎn)生相應的蛋白質(zhì)（或酶）。因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達的主要標志，檢測蛋白質(zhì)的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與*抗體共孵。*抗體專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合，然后用另一種蛋自質(zhì)，如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結(jié)合上去的抗體。本法所需時間6小時或過夜。
蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳
幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。zui常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
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