熒光定量PCR試劑盒是一種用于定量檢測(cè)DNA或RNA的試劑盒，其工作原理主要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光探針技術(shù)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的技術(shù)，通過(guò)重復(fù)的變性、退火和延伸循環(huán)，使目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。在熒光定量PCR試劑盒中，首先將待測(cè)樣品與試劑盒中的試劑混合，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。在每個(gè)循環(huán)中，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量都會(huì)增加一倍，從而使得熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)。
熒光探針技術(shù)是其核心部分。在反應(yīng)體系中，除了常規(guī)的PCR引物外，還加入了一段特異性的熒光標(biāo)記探針。這段探針通常被設(shè)計(jì)為與目標(biāo)DNA片段互補(bǔ)，并在其5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(如FAM)，在3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(如TAMRA)。當(dāng)探針與目標(biāo)DNA片段結(jié)合時(shí)，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離變近，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。然而，在PCR延伸階段，由于Taq酶具有5'到3'的外切酶活性，會(huì)將結(jié)合在目標(biāo)DNA上的探針切斷，使得報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)得以釋放并增強(qiáng)。
通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，可以準(zhǔn)確地定量分析目標(biāo)DNA片段的初始濃度。在熒光定量PCR試劑盒中，通常會(huì)設(shè)置一個(gè)閾值，當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到該閾值時(shí)，所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(CycleThreshold)。Ct值與目標(biāo)DNA片段的初始濃度呈負(fù)相關(guān)，即目標(biāo)DNA片段越多，Ct值越小。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可以計(jì)算出待測(cè)樣品中目標(biāo)DNA片段的初始濃度。
熒光定量PCR試劑盒具有高靈敏度、高特異性、寬動(dòng)態(tài)范圍和低變異系數(shù)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析、遺傳疾病診斷等領(lǐng)域。通過(guò)使用不同的熒光標(biāo)記探針和引物，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)DNA片段的同時(shí)檢測(cè)和定量分析。
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