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| 常規(guī)切片的注意事項(xiàng) |
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| 點(diǎn)擊次數(shù)：1030 更新時(shí)間：2017-05-09 |
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1 . ELISA試劑盒取材
取材的好壞，直接影響切片的質(zhì)量。醫(yī)生在取材時(shí)，首先要有一把鋒利的取材刀，在切割組織時(shí)要避免取材刀來(lái)回拖拉，切取的組織塊厚薄要均勻，一般厚度以0.2 ～0.3cm為
適，較容易發(fā)脆的組織如甲狀腺、肝臟、淋巴結(jié)、大塊癌組織等可適當(dāng)厚一點(diǎn)，而脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應(yīng)取薄一些；
淋巴結(jié)應(yīng)修掉兩側(cè)球冠，并盡量剔除周?chē)闹窘M織。在取材中還應(yīng)十分注意組織內(nèi)是否有縫線或骨組織，如碰到不可避免的鈣化組織，應(yīng)與技術(shù)室講明，在切取纖維組織、肌肉
組織、胃腸道時(shí)，應(yīng)注意纖維及肌肉的走向，取材時(shí)盡可能按與纖維平行走向切取為佳。
2 . 固定
固定是技術(shù)室工作的*步，也是在整個(gè)制片過(guò)程中無(wú)法補(bǔ)救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位
置的過(guò)程。固定的目的是為了防止組織細(xì)胞自溶，防止了細(xì)胞內(nèi)的酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各和成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以
保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。另外，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加組織韌性，而且不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時(shí)固定，固定液的量
應(yīng)為組織的5倍。固定的關(guān)鍵主要與固定的及時(shí)性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時(shí)間有關(guān)。zui常用的固定液為10％福爾馬林。筆者認(rèn)為，10％福爾馬林由于受到福
爾馬林的質(zhì)量、使用時(shí)的揮發(fā)和取材時(shí)帶入的水分影響，濃度被降低致組織固定不足，而高濃度的福爾馬林，降低了對(duì)組織的穿透性，形成周?chē)潭ê枚?固定不到的現(xiàn)象。
所以, 盡管中性福爾馬林對(duì)抗原有很好的保存作用，但酸性福爾馬林對(duì)絕大多數(shù)抗原來(lái)說(shuō)也有很好的保存作用，所以在沒(méi)有特別處理的情況下常規(guī)HE用12～15％酸性福爾馬林也可
以（每100毫升12～15％福爾馬林液內(nèi)加5毫升冰醋酸）。骨髓、結(jié)締組織固定以Bouin液為佳，經(jīng)Bouin液固定后的組織必須流水沖洗4小時(shí)以上。有條件的單位可根據(jù)不同要求選用
二種或二種以上的固定液；少數(shù)單位還可建立組織冷凍庫(kù)，以便適應(yīng)各種特殊的處理要求。
3. 水洗
固定后水洗（10～20分鐘），通常被很多人所忽視，而水洗不*，容易造成脫片和染色不鮮艷。對(duì)需做免疫組織化學(xué)的組織，更不應(yīng)當(dāng)忽視。福爾馬林不利于組織塊內(nèi)抗原
的保存
4 . 脫水和透明
所謂脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來(lái)，以利于有機(jī)溶劑的滲入，這一過(guò)程稱為脫水。脫水是否*，直接關(guān)系到組織是否能充分透明，而脫水過(guò)度（原因是組織
在純酒精內(nèi)時(shí)間過(guò)久，發(fā)生組織質(zhì)地發(fā)生變化）容易造成組織發(fā)脆。造成組織發(fā)脆的原因還有加溫（溫度超過(guò)35℃）、脫水劑內(nèi)加有丙酮、浸蠟用的石蠟中二甲苯過(guò)多等等。一般
我們總認(rèn)為組織發(fā)脆跟高濃度酒精有關(guān)，而忽視了與低濃度的酒精關(guān)系，其實(shí)低濃度的酒精具有強(qiáng)大的穿透力，比純酒精更容易滲透到組織塊內(nèi)部使之脫水，組織如果在低濃度酒
精里充分脫水，在高濃度酒精里只需脫去從低濃度到高濃度之間的水份，因此，僅需短時(shí)間就可完成，如果這時(shí)不縮短純酒精的時(shí)間，便會(huì)引起組織發(fā)脆；如果脫水時(shí)加溫，使用
丙酮，還可引起組織收縮，并影響免疫組織化學(xué)的標(biāo)記。為了使石蠟浸入到組織塊內(nèi)，必須經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)，這個(gè)過(guò)程稱透明。目前
的透明劑是二甲苯。很多人認(rèn)為二甲苯極容易使組織發(fā)脆，這個(gè)觀點(diǎn)很片面，在常溫下，如果不是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)２4小時(shí)以上）二甲苯并不會(huì)引起組織過(guò)份發(fā)脆，相反會(huì)使某些組
織結(jié)構(gòu)比較質(zhì)韌的組織：比如子宮肌瘤等相當(dāng)好切），但是當(dāng)二甲苯溫度超過(guò)35℃以后，極易引起組織發(fā)脆。所以本人認(rèn)為，大小標(biāo)本分開(kāi)脫水，一般情況下，大標(biāo)本脫水時(shí)
間（室溫18℃）以80％酒精2小時(shí)、95％酒精（2道）各1個(gè)半小時(shí)至2小時(shí)、純酒精（3道）各1個(gè)半小時(shí)至2小時(shí)，二甲苯（2道）各30-60分鐘為宜；小標(biāo)本脫水時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短。脫
水時(shí)間長(zhǎng)短，與室溫高低有密切的相關(guān)。我們?cè)趯?shí)踐中發(fā)現(xiàn)，室溫在12～15℃時(shí)，可作為一個(gè)臨界溫度范圍。ELISA試劑盒當(dāng)室溫高于此溫度范圍時(shí)，組織容易脫水，可適當(dāng)縮短脫水時(shí)間；而
室溫低于該溫度范圍時(shí)，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間。更換試劑，應(yīng)以量為基礎(chǔ)，定量更換，不能等到切片不好時(shí)再去更換。否則，至少會(huì)有2～3
批組織切片不好。根據(jù)我科經(jīng)驗(yàn)，如試劑用量為500ml，每500個(gè)蠟塊更換一次為宜。
5. 浸蠟
組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱為浸蠟。用其他浸透劑（如火棉膠、明膠等）滲入組織內(nèi)部的過(guò)程可稱為浸透或透入。浸蠟溫度過(guò)高（超過(guò)60℃），在蠟內(nèi)加入二
甲苯蠟或由于透明時(shí)帶進(jìn)的二甲苯過(guò)多，都會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬，還會(huì)使組織內(nèi)的抗原受到破壞；所以作者主張浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)在56℃（三道），*道：石蠟30分鐘；第二道：石
蠟90分鐘；第三道：石蠟，90分鐘。浸蠟溫度控制在56～58℃左右。（*道也可用硬脂酸石蠟1：3混合浸蠟，不僅可軟化組織，特別適用于比較韌、硬的組織，而且由于硬脂酸
是弱酸性的，對(duì)細(xì)胞核有媒染作用，核漿比鮮明，但容易脫片；同時(shí)對(duì)疏松組織容易散片）。有條件的可以每天打開(kāi)*道石蠟的蓋子，讓二甲苯揮發(fā)。浸蠟所用的石蠟如有雜質(zhì)
盡可能過(guò)濾，以防附在組織上，造成切片刀刀口受損，或切片破碎和劃痕增多。
6. 包埋
用包埋劑來(lái)支持組織的過(guò)程稱包埋。zui常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵一是平整，二是方位。要求在包埋時(shí)，應(yīng)采用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用
組織的zui大面包埋。囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。小塊多顆組織，應(yīng)盡量放在一起，并保證在一個(gè)平面上。修去兩邊的余蠟（所謂的兩邊，指切片時(shí)與切片刀垂直的兩側(cè)）。包埋
時(shí)還應(yīng)注意有無(wú)縫線，紙絮，如有一定要去除。胃黏膜活檢標(biāo)本，不能按一般的規(guī)律取zui大包埋面，應(yīng)采取窄面豎起包埋。包埋的蠟更應(yīng)過(guò)濾，留有雜質(zhì)的石蠟，容易造成污染或
刀口受損。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)在56～58℃之間選擇，不提倡在冬天使用軟蠟。因?yàn)橛密浵灠竦南瀴K，到了夏天，會(huì)粘在一起，不利于資料的保存，而且即使在冬天，用硬蠟包埋的蠟塊
也比用軟蠟包埋的蠟塊要好切。
7. 磨刀
要想切好一張切片，首先要有一把鋒利的切片刀。磨刀是從事切片技術(shù)人員的一項(xiàng)zui基本技術(shù)，刀磨的好壞，直接關(guān)系到切片的質(zhì)量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均
勻，使刀口和磨刀石全面接觸，兩手的用力點(diǎn)應(yīng)在刀口上，而不是在刀背上。切片刀應(yīng)用一次磨一次，每次僅需10～15分鐘，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的磨刀，容易把已經(jīng)磨出的鋒刃磨掉，檢查
切片刀是否鋒利，用手試摸刀口的方法并不十分科學(xué)，不僅不能證明切片刀是否真正鋒利，而且容易損害刀口，zui簡(jiǎn)單的辦法是每次磨好后拿一個(gè)蠟塊試切一下。每次磨好刀后，
應(yīng)將磨刀石用蓋子蓋好，以防灰塵掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，會(huì)使切片刀產(chǎn)生許多細(xì)小的缺口?，F(xiàn)在很多單位都買(mǎi)了磨刀機(jī)，磨刀機(jī)用來(lái)開(kāi)刀鋒和磨缺口的確不錯(cuò)，但
由于磨刀的角度和時(shí)間不易掌握，故效果并不理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，真正的鋒刃很難用機(jī)器磨出來(lái)。一次性刀片在很大程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。如用一次性刀片，必須及時(shí)
更換刀口。一個(gè)刀口切小標(biāo)本不應(yīng)超過(guò)20～25只蠟塊，切大標(biāo)本不應(yīng)超過(guò)10～15只蠟塊。
8. 切片
切片的*步必需粗切。粗切的厚度大約在５0～100微米左右，質(zhì)地較硬的組織或較小的組織應(yīng)再薄一些，粗切致組織全部暴露后，才進(jìn)行細(xì)切。細(xì)切至組織塊表面均勻一致
，無(wú)白點(diǎn)后，再把切的蠟片放入溫水中。切片時(shí)要求用力均勻、柔和，搖速不易過(guò)快或過(guò)慢。過(guò)快會(huì)導(dǎo)致切片厚薄不均，機(jī)器磨損；過(guò)慢會(huì)使切片增厚。切片厚度一般為3～5微米
。切片的要求是完整、薄、均勻。切下的片膜其大小形狀應(yīng)與組織塊一致，切片的不完整，常會(huì)將重要病變遺漏，導(dǎo)致誤診、漏診。在切片放蠟塊時(shí)，應(yīng)注意組織包埋的方向，組
織的層次，纖維、肌肉等的走向應(yīng)與切片刀平行，較難切的部分應(yīng)放在上面，如皮膚的表皮，腫塊的包膜，胃腸道的漿膜等，這樣可以減少組織的斷裂現(xiàn)象。操作切片機(jī)時(shí)應(yīng)用力
均勻，避免用力過(guò)重。對(duì)脫鈣組織、骨髓，以及已知的鈣化組織，應(yīng)選用固定的刀口，以減少其他部位出現(xiàn)缺口的可能性。在使用毛筆展片時(shí)要防止筆絲進(jìn)入刀口，因?yàn)槊壳械揭?nbsp;
根筆絲，就會(huì)增加一個(gè)缺口。切片厚度一般為4～6微米，有人認(rèn)為：只要切片機(jī)刻度標(biāo)著幾個(gè)微米，切出來(lái)的片子就是幾個(gè)微米。其實(shí)不然，當(dāng)切片刀不鋒利，或切片時(shí)速度不勻
，或切的較慢時(shí)，切的片子都會(huì)變厚，只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下，才能真正保證其厚度。下面是切片時(shí)碰到的問(wèn)題的原因及可能處理的方法：（1）組織發(fā)脆：一般
是脫水、透明、浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)，在切片時(shí)，邊切邊用嘴向蠟片吹氣，可能會(huì)好些。（2）切片卷起，可能是刀不鋒利，或刀鋒在另一面，或刀角
度過(guò)大，切片太厚等等。（3）蠟片彎曲：可能是刀鋒不均，切片刀未磨直，切片刀與蠟塊不平行。（4） 透明、浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)（5）厚薄不均：可
能是刀、刀座及蠟塊未夾緊，組織太硬，或切片機(jī)主軸太向前，或切片機(jī)已磨損。（6）切片出現(xiàn)裂痕：可能是刀有缺口，石蠟內(nèi)有雜質(zhì)，組織內(nèi)有鈣化、骨片或有線結(jié), 也可能會(huì)有
棉紙纖維等。（7）切片不連片，切不下片，切片很厚，或者切片后蠟塊發(fā)白，內(nèi)陷：組織脫水不佳。補(bǔ)救辦法：可先將蠟塊溶解，取出組織，放入加熱水浴的丙酮內(nèi)（80℃），30～
60分鐘，再進(jìn)行透明浸蠟包埋切片，也許會(huì)好一點(diǎn)。
9. 展片與撈片
展片水溫應(yīng)在42℃至47℃之間，這主要和包埋蠟的熔點(diǎn)有關(guān),水溫過(guò)高，會(huì)引起組織細(xì)胞散開(kāi)，水溫過(guò)低，切片皺摺無(wú)法攤平。包埋蠟中如有二甲苯，也會(huì)造成石蠟溶解現(xiàn)象。
而用一次性刀片切的片子，一碰到熱水，片子上的皺摺就無(wú)法再展開(kāi)，這有二個(gè)方法可以解決：*、可以在切片時(shí)邊切邊向蠟片吹氣，這樣的片子就會(huì)非常平整，放到熱水里就
會(huì)自然展開(kāi)，比較方便快捷，但這樣的片子會(huì)略微厚一點(diǎn)；第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，讓酒精的張力自動(dòng)把皺摺展開(kāi)，然后再將切片移到熱水，這樣的
片子會(huì)較薄;如酒精濃度過(guò)高，容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙，像脂肪之類細(xì)胞間粘附性較小的組織一碰到酒精就會(huì)散開(kāi)，故不能用此法。zui后撈片時(shí)玻片要干凈，要選擇那些完整
、無(wú)皺摺的切片，粘貼于玻片中1/3和下1/3的中間。
10. 烤片和脫蠟
烤片，一般在60℃的溫箱內(nèi)烤片0.5～1小時(shí)左右，溫度過(guò)高，會(huì)引起切片細(xì)胞收縮；時(shí)間太短（少于20分鐘），容易造成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著
色或著色不勻，所以，脫蠟用的二甲苯要經(jīng)常更換，一般用3道二甲苯，每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。當(dāng)室溫低于18℃時(shí)，必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲
苯中脫蠟，或?qū)⒍妆椒湃霚叵鋬?nèi)預(yù)熱（37℃左右）脫蠟，zui高不得超過(guò)60℃。然后經(jīng)高濃度的酒精到低濃度的酒精洗去二甲苯，至水。
11. 染色
蘇木素染色時(shí)間要根據(jù)染料的新舊、溫度、切片的類型而定，一般為5－15分鐘。經(jīng)水略洗后，用鹽酸酒精分化，分化程度必須用顯微鏡控制。分化水洗后，可用溫水或自來(lái)水
藍(lán)化，并充分水洗（流水沖洗5分鐘以上），以防鹽酸殘留導(dǎo)致切片褪色。我們不提倡使用堿性溶液（釋氨水、肥皂水等）促藍(lán)，盡管藍(lán)化效果很好，但從實(shí)踐的結(jié)果來(lái)看，用堿性
溶液促藍(lán)的切片不能長(zhǎng)期保存，容易褪色。zui后入伊紅復(fù)染（5－20秒）。HE染色的關(guān)鍵在于深淺適度，對(duì)比鮮明，一般有經(jīng)驗(yàn)的，肉眼就能判斷，但偶而也會(huì)出現(xiàn)失誤，所以用顯
微鏡控制是zui保險(xiǎn)的方法。其關(guān)鍵的步驟在于蘇木素染好后的分化及藍(lán)化過(guò)程，在藍(lán)化結(jié)束后，應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞核著色是否合適，核結(jié)構(gòu)是否清晰，胞漿內(nèi)是否有殘留的蘇
木素等等。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是：細(xì)胞核與細(xì)胞漿應(yīng)藍(lán)紅相映，鮮艷美麗；核漿對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(jiàn)。
12. 脫水和封片
切片脫水應(yīng)從低濃度的酒精到高濃度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，純酒精2道，（正丁醇1道），二甲苯2道。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易使伊紅
退色，故脫水時(shí)間可短一點(diǎn)，每道3－5分鐘，純酒精每道10分鐘。為增加酒精與二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但用石碳酸時(shí)如
不洗凈，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推薦。切片經(jīng)二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封固。為增加切片的透明度，防止細(xì)胞收縮、龜裂或切片出現(xiàn)黑色結(jié)晶樣小點(diǎn)。所以
我們規(guī)定切片必須濕封，不得用溫箱烤干或電吹風(fēng)吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季節(jié)，封片時(shí)要防止口鼻呼出的氣體接觸到切片；在天氣較潮濕的日子里，不宜一次將多張
切片取出待封，以免切片“還潮”，形成透明不佳,出現(xiàn)云霧狀水珠。脫水劑的更換也應(yīng)有一定的時(shí)間規(guī)定。一般是每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。封片樹(shù)膠不能過(guò)
稀，封片時(shí)樹(shù)膠要均勻充滿蓋玻片且樹(shù)膠不及外溢為佳。要將組織全部覆蓋，也不能有氣泡。zui后，ELISA試劑盒粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè)，編號(hào)書(shū)寫(xiě)清楚，能打印。 |
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