Western Blotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法
*種是超級簡便的標(biāo)記內(nèi)參使用法，TSZelisa試劑盒只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可;
第二種是普通內(nèi)參，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
第三種，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。
actin即肌動蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(β- non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。beta-actin作為內(nèi)參是得到了*的，TSZelisa試劑盒這是針對大多數(shù)組織和細(xì)胞來說的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。盡管zui近有一些文章已經(jīng)開始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性(好像是對于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了)，但是發(fā)文章應(yīng)該還是沒有問題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類似，是細(xì)胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個(gè)代替品。三種同時(shí)發(fā)生變化的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA，TATA-box bingding protein(TBP)甚至線粒體的內(nèi)參來代替，當(dāng)然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。
actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內(nèi)參時(shí)首先得保證是組織廣泛表達(dá)的(尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時(shí))。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細(xì)胞外,TSZelisa試劑盒還可以檢測cardiac，skeletal，smooth muscle細(xì)胞的actin。
