要一次進行這么多種反應(yīng)，我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。zui后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時候，增加鹽總會有幫助，尤其能增加特異性。"ELISA試劑盒
PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計的，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題。如果一個目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景?！拔覀兊亩嘀豍CR試劑盒能夠在同一個管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性，"Mason說。
我能擴多少目標(biāo)片段一般來說，zui多能在同一個管中同時檢測到五個目標(biāo)片段，這既是出于引物設(shè)計的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實時熒光PCR儀通常zui多檢測4至5個顏色通道，其中一個可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是zui多達到五重PCR。 “設(shè)計更多是挑戰(zhàn)性的，"Cockrum說。
多重定量PCR的染料能進行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio? 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了VIC外，近期又發(fā)布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。ELISA試劑盒
Cockrum建議將染料強度與模板豐度結(jié)合起來，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡 的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度zui高的模板（如看家基因）。
更多重的PCR當(dāng)然，引物設(shè)計是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時篩選十個以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。ELISA試劑盒
