外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長(zhǎng)，lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄。向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達(dá)。表達(dá)的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測(cè)。
1．目的
了解外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)和方法。
2．原理
外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長(zhǎng)，lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄。向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達(dá)。表達(dá)的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測(cè)。
3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。
4．試劑
LB培養(yǎng)基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。
5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
無(wú)菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/ml IPTG （過(guò)濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），100mg/ml氨芐青霉素（過(guò)濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中，終濃度為0.2%）。
6．操作步驟
（1） 晚上9：00接種。在超凈工作臺(tái)中接種含有Pinpoint™xa-3-CHI重組載體的菌株，培養(yǎng)于兩個(gè)三角燒瓶各20ml LB-葡萄糖培養(yǎng)基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的搖菌管中，慢速70~90轉(zhuǎn)/分鐘30°C搖菌過(guò)夜。
（2） 至第二天上午8：30 OD600約為0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170轉(zhuǎn)/分鐘37°C誘導(dǎo)1.5-3h。同時(shí)做不加IPTG誘導(dǎo)和非轉(zhuǎn)化的空菌誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)。
（3） 4000rpm離心15min棄掉上清液，收獲菌體，用SDS-PAGE電泳分析（表達(dá)蛋白分子量為30kDa）。菌體也可放在-20°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>
（4） 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。
詳細(xì)請(qǐng)看：外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
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